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    技術文章

    常用的合成培養基
    點擊次數:1015 發布時間:2016-01-08

        合成培養基是在平衡鹽溶液中加入標準的化學營養物質而構成的培養基,現已成為普遍應用的標準化的商品。盡管目前合成培養基含量豐富,但尚不能完全滿足體外細胞生長的需要,使用時仍需或多或少的添加一定比例的天然培養基,主要是牛血清。

    .合成培養基主要成分人工合成培養基的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些輔助物質。

    ()氨基酸:合成培養基內的氨基酸以必需氨基酸為主。這些氨基酸不能由細胞自身合成,必須依靠培養液供給。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異,幾乎所有的細胞均對有較高的要求,的缺乏可致細胞生長不良而死亡。由于在溶液中很不穩定,應單獨配制, 20℃冰凍保存,用前加入培養液內。已含有的培養液在4℃冰箱中貯存兩周以上,應補充原來量的。此外,配制培養液時應使用細胞能利用的L型異構體氨基酸,盡量避免使用D型氨基酸。

    (2)碳水化合物:碳水化合物是細胞生長能量的來源,也參與蛋白質和核酸的合成,主要包括葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。

    (3)維生素:維生素在細胞代謝中主要參與形成輔酶、輔基。維生素分為水溶性和脂溶性兩大類,配制時應注意。

    (4)無機離子:細胞生長過程中需要鈉、鉀、鈣等無機鹽,有的培養液中含一些微量元素如:Fe 2+、Zn 2+ 、Cu 2+一等。

    (5)其他成分:有的較為復雜的培養液中還需添加核酸降解物、氧化還原劑、三磷腺苷(ATP)和等。

        目前一些常用培養液已制成干粉的商品出售。其配方均已相對固定,成分趨于簡單化,僅能維持細胞生長的zui低要求。在一些特殊情況下,應根據實驗的需要補充其他的成分。如芷雜交瘤技術中常用的DMEM培養液,使用時還要補加丙酮酸鈉和2一巰基乙醇等。

    2.常用的合成培養基

    ()MEM也稱低限量Eagle培養基,成分簡單。它僅含有2種必需氨基酸、、8種維生素及必要的無機鹽。實際應用時可根據實驗需要添加某種特殊成分進行某些特殊細胞的培養。

    (2)I)MEM是在MEM基礎上增加了各種成分的用量,可分為高糖型和低糖型。高糖型含葡萄糖45500g/L,低糖型含量為000g/L。高糖型適用于生長較快,附著性差的腫瘤細胞培養。

    (3)RPMI 640是由Moor等人針對培養小鼠白血病細胞而設計。開始的配方特別適用于懸浮細胞的生長,主要針對淋巴細胞,后經幾次改良從RPM 630、634,而至RPMI640。其組分較為簡單,適合于許多種類細胞的生長,如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養或傳代培養的細胞。RPMI 640目前已經成為應用的培養基之一。

    (4)HamF2培養液962年Fam研究了適合小鼠二倍體細胞克隆化的培養基,命名為F7,在此基礎上進行改良成為F0培養基,使之不僅適應小鼠細胞而且也適用于人類二倍體細胞的培養。965年Fam在原有配方的基礎上加入了一些微量元素和無機離子,研制了F2培養基。該培養基可在加入很少血清的情況下應用.特別適合進行單細胞培養和克隆化培養,也是無血清培養中常用的基礎培養基。

        上述為幾種zui為常用的培養基,現已成為細胞培養普遍應用的商品化的培養基。目前培養基的種類雖已達數十種,但多以上述幾種為基礎加以改良而制備。實驗者可根據需要進行成分的增減和選擇,若無特殊要求,上述培養基基本上可以滿足絕大部分細胞培養的需要。

    3.合成培養基的配制 由于培養液的配制過程繁雜、費時費丁,現在大部分合成培養基已制成標準化的商品出售,已很少有實驗室自己配制培養基。商品化的液體培養基購回后可直接或稀釋后使用。粉制的培養基也只需按照說明書,簡單配制后即可使用,方便快捷。粉制培養基的配制時需要注意以下幾點:

    ()所用器皿應徹底清洗干凈,烤干后備用。

    (2)配制培養液及所使用的相關液體均需新鮮制備的三蒸水,并保證水的純度和質量。

    (3)認真閱讀說明書,根據配制說明的要求添加干粉中不包含的成分,如NaHCO3 、等,也可根據實驗的要求來決定。

    (4)配制時要保證干粉充分溶解,NaHCO3 、等要在培養基完全溶解后才能添加。

    (5)培養液中添加的血清質量應保持穩定,一項實驗盡量采用同一批號血清。

    (6)常用培養液的pH值范圍為7.2~7.4。需要注意的是配制過程中,添加血清、抗生素以及過濾除菌等均可引起pH值的改變,多采用HCl和NaOH進行相應調整。

    (7)配制好的培養液應馬上過濾除菌,并進行無菌實驗,4℃保存。每批次配制的液體數量以使用兩周左右為宜,以免時間過長造成營養成分損失。

    (8)培養液中血清添加量可根據實驗需要進行適當的調節。若培養液主要為細胞生長增殖之用,所含血清比例較大。一般配法:基本培養基80%~90%,小牛血清0%~20%,并加雙抗生素(00U/m.00μg/ml),上述比例如有特定需要,可根據細胞培養要求進行增減;若主要作用是維持細胞緩慢生長而不死(如增殖病毒時),一般血清含量較少,通?;九囵B基為97%~98%,小牛血清3%~2%。

    4.無血清培養基因血清所含成分復雜,同時也含有一些不可控因素,細胞毒性物質和抑制物,不僅影響細胞生長和細胞某些功能的表達,有的還會對細胞產生去分化作用,影響一些基礎醫學研究的結果。因此,一些技術要求和研究目的較高的細胞培養,如細胞生長因子研究和制備、單克隆抗體制備、細胞分泌產物的研究和制備等,都須用無血清培養基.以減少或去除異種蛋白及干擾因素。

    無血清培養基主要有基礎培養基和輔加成分組成:

    ()基礎培養基:一般用人工合成培養基,zui常用的是HamF2和DMEM培養基l:混合。然后補加5mmol/L Hepes,.2g/ml NaHCO3作為基礎溶液。

    (2)輔加成分有:①促貼壁附著成分,如纖維粘連蛋白、層粘連蛋白膠原等。②促生長增殖成分,如一些生長因子和激素。③蛋白酶抑制物,如大豆抑制劑(soybean trypsin inhibitor)。

        這些輔加成分根據細胞生長條件和實驗要求添加。一般先配好儲存液,過濾除菌,低溫保存,要避免反復凍融。使用濃度和使用方法各不相同。如纖維粘連蛋白的配制濃度為25mg~50mg/L,用時先涂在培養瓶皿支持物上;層粘連蛋白~5mg/L,可直接加在培養液中。成纖維細胞生長因子配制濃度2mg/L,使用濃度5μg/L,可直接加入培養液中;大豆抑制劑,使用濃度為O.%~O.5%,通常配制在基礎培養液中。

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