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    技術文章

    乳酸脫氫酶的檢測方法
    點擊次數:779 發布時間:2016-01-06

        乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是細胞能量代謝(糖酵解)中的一個重要的酶,可以催化乳酸生成丙酮酸,同時產生ATP。正常情況下LDH不能透過細胞膜,但當細胞受損或死亡時,細胞膜通透性增強,LDH會從胞漿中露出,細胞質內LDH減少,培養液中LDH增多。因此LDH是質膜完整性的標志,也是檢測細胞活性的指標,培養液中LDH越高就說明細胞損傷越嚴重。

        LDH在有輔酶I攜帶氫的情況下,催化乳酸與丙酮酸之間的可逆反應。在pH 0的條件下,以乳酸為基質,經LDH作用后,測定生成的丙酮酸量,從而推知LDH的活性。

    (一)材料

    .96孔培養板培養的待測細胞和對照細胞培養上清液。

    2.0.mol/L緩沖液、甘油酸7.505g、NaCl 5.85g,溶于雙蒸水至000ml。

    3.緩沖基質液(pH 0.O):70%乳酸鈉溶液0ml,0.mol/L緩沖液25ml,0.mol/L NaOH 75ml,加氯仿數滴防腐,4℃保存備用。

    4.輔酶I溶液:輔酶I 0mg溶于2ml雙蒸水中,4℃保存備用。

    5.2,4一二硝基苯肼溶液:20mg 2,4一二硝基苯肼溶于0ml 0mol/L HCl中后,用蒸餾水定容至00ml,4℃保存備用。

    6.丙酮酸標準液:準確稱取干燥至恒重的丙酮酸mg,用0.mol/L H2SO4溶解后定容至00ml,4℃保存備用。此標準液相當于lμmol/L丙酮酸。

    (二)方法

    .繪制標準曲線。

        將各試管置于37℃水浴5min后,各管加入0.4 mol/L NaOH 0ml,混勻后室溫放置5min,以號管為空白,將試管分別于440nm測定各孔光吸收值,記錄結果。以LDH量為橫坐標,各管吸光密度值為縱坐標,繪制標準曲線。

    2.培養液中LDH測定。

    (三)結果分析

        混勻后室溫下放置5min,以對照管為空白,440nm比色。根據標準曲線確定細胞培養液中的LDH活性。本法操作簡便快捷,自然釋放率低,可用于CTL及NK細胞活性測定及藥物、化學物質或放射引起的細胞毒性,現已有LDH法測定CTL活性試劑盒。

    (四)注意事項

    .各管吸光密度值若過高,應對細胞培養液進行稀釋。

    2.確保每管的反應時間一致。

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