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    技術文章

    混合淋巴細胞培養
    點擊次數:782 發布時間:2016-01-04

    (一)原理

        混合淋巴細胞培養(mixed lymphocyte culture,MLC)或稱混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction,MLR),包括雙向和單向混合淋巴細胞反應兩種。兩個無關個體功能止常的淋巴細胞在體外混合培養時,由于HLAⅡ類抗原中D和DP抗原(淋巴細胞鑒定的抗原,SD抗原)不同,可相互刺激對方的T細胞發生增殖,此為雙向混合淋巴細胞培養(雙向MLC);若將其中一方的淋巴細胞先用C(myrtomycine C)處理或射線照射使細胞中DNA失去復制能力,但仍能刺激另一方淋巴細胞發生轉化.稱為單向混合淋巴細胞培養(單向MLC)。MLR可通過3 H—TdR摻入率、形態學檢查法及MTT法檢查反應細胞的增殖能力。MLR主要用于移植前組織配型,也是免疫調節研究中的實驗模型。本節介紹單向MLC二方法。

    (二)材料

    .供者和受者淋巴細胞懸液,濃度為l×06/ml。

    2.C、3 H—TdR。

    3.20%NCS RPMI 640培養基。

    (三)方法

    .刺激細胞的準備 在淋巴細胞懸液內加入C,zui終濃度為25μg/ml,于37℃水浴中作用30min,000r/min離心0min,棄上清液,沉淀細胞用Hank’s液洗滌3次。

    2.反應細胞的準備將分離純化的淋巴細胞調整細胞濃度為×06/ml。

    3.取刺激細胞和反應細胞各O.2ml,加入.8 ml  20%NCS RPMI 640培養基,置37℃、5%C02孵育6d。

    (四)結果分析

    .形態學方法以轉化細胞百分率判斷淋巴細胞反應強度,一般認為轉化率小于5%為陰性。

    2.3 H—TdR摻入法終止培養前20h加入74kBq 3 H—TdR。終止培養后,按照前述增殖實驗3 H—TdR摻入法收集細胞測定cpm值,并計算SI。

    3.MTT法終止培養前6h加入MTT。培養終止后加酸化異丙醇O.ml,充分混勻,靜置數分鐘,按MTT比色法測OD值,并計算SI。

    (五)注意事項

    .增殖反應的細胞應保持高活性,一般應大于或等于95%。此外,增殖細胞的濃度過高或過低均不利于細胞生長。

    2.絲裂原刺激淋巴細胞增殖時,常需要一定數量的抗原遞呈細胞同時存在,否則難以測出細胞的增殖反應。

    3.注意無菌操作。

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